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Im Januar 1993 begann in den USA die Ausstrahlung der Serie Star Trek: Deep Space Nine. Die Geschichte verläuft zunächst parallel zu der von Raumschiff Enterprise: Das nächste Jahrhundert. Im Gegensatz zu den vorangegangenen beiden Serien spielt hier die Handlung nicht auf einem Raumschiff, sondern auf einer Raumstation. Die Station liegt im Randbereich des Einflusses der Föderation und gewinnt an strategischer Bedeutung, als sich durch die Entdeckung eines in unmittelbarer Nähe gelegenen Wurmlochs das Tor zum unerforschten Gamma-Quadranten der Milchstraße öffnet. In der dritten Staffel wurde das auf Deep Space Nine stationierte Kriegsschiff USS Defiant als Schauplatz eingeführt, das im weiteren Verlauf immer wichtiger wird.

Roddenberry verstarb 1991 vor der Realisierung des Projekts. Sein Nachfolger wurde Rick Berman. Mit Deep Space Nine wandelte sich auch der Charakter Star Treks weg vom allzu Optimistischen: Präsentiert wird eine beschädigte Welt. Erhalten blieb jedoch der ethisch-moralische Diskurs und ein progressiver Charakter: Der kommandierende Offizier ist ein Afro-Amerikaner. Wie bereits in den 1960er Jahren sorgte 1995 eine Szene für einen Skandal. Die Episode, die einen Kuss zweier Frauen zeigt, wurde darum in einigen US-Staaten nicht ausgestrahlt.

Deep Space Nine endete – ebenfalls erfolgreich – nach sieben Staffeln und 176 Episoden im Juni 1999.

Als die Cardassianer im Jahr 2369 die Raumstation „Terok Nor“ aufgeben und sich vom Planeten Bajor zurückziehen, in dessen Orbit sie sich befindet, geht sie in bajoranisches Eigentum über und wird fortan als Raumstation „Deep Space Nine“ gemeinsam mit der Vereinigten Föderation der Planeten betrieben. Das Kommando über die Station erhält der Sternenflottenoffizier Benjamin Sisko, erster Offizier und zugleich bajoranischer Verbindungsoffizier wird die Bajoranerin Kira Nerys. Nachdem in der Nähe von Bajor ein stabiles Wurmloch entdeckt wird, das die Passage in einen weit entfernten Teil der Galaxis ermöglicht, den bisher kaum erforschten Gamma-Quadranten, wird die Station verlegt und direkt vor der Anomalie positioniert. DS9 wird dadurch zu einem bedeutenden Handels- und Forschungsstützpunkt. Nach der Entdeckung des Wurmlochs wird Sisko durch die Bajoraner als „Abgesandter“ der Propheten verehrt, die dem bajoranischen Volk als Erschaffer des Wurmlochs gelten. Dadurch gelangt Sisko zudem in eine spirituelle Rolle.

In den ersten Staffeln geht es vor allem um die Konflikte zwischen Bajoranern, der Föderation und den Cardassianern. Mit dem Ende der zweiten Staffel wird mit dem Dominion eine neue Partei in die Handlung eingeführt. Dabei handelt es sich um die dominierende Macht im Gamma-Quadranten, die von den „Gründern“ angeführt werden. Die Gründer, welche auf Grund ihrer gestaltwandlerischen Fähigkeiten auch als „Wechselbälger“ bezeichnet werden, haben zwei Spezies - die Vorta und die Jem'Hadar - genetisch so verändert, dass diese die Gründer als Götter verehren und ihnen bedingungslos gehorchen.

Kennzeichen der Handlung sind wechselnde Allianzen und Auseinandersetzungen zwischen Föderation, Klingonen, Cardassianern, Romulanern, Breen, dem Dominion und Bajoranern. Innerhalb der verschiedenen Mächte gibt zusätzlich noch unterschiedliche Abspaltungen: So kämpft auf Föderationsseite die Rebellenorganisation Maquis einen Guerillakrieg gegen die Cardassianer, Geheimdienste wie der Obsidianische Orden oder Sektion 31 handeln autark und teilweise gegen ihre eigenen Regierungen. Die Station befindet sich immer wieder mitten im Geschehen und ist auch Zufluchtsort für Flüchtlinge.

Die Schauplätze der Serie sind nicht auf die Station beschränkt. Der Besatzung stehen stets Shuttleschiffe, sogenannte Runabouts („Flitzer“) zur Verfügung, die nach Flüssen der Erde benannt sind (zum Beispiel Yukon, Mekong, Orinoco, Rio Grande oder Ganges). Zu Beginn der dritten Staffel wird das Raumschiff USS Defiant in die Serie aufgenommen, das als Kriegsschiff konzipiert ist und über eine romulanische Tarnvorrichtung verfügt. Bis zur siebten Staffel ist das verhältnismäßig kleine Raumschiff, das nur über vier oder fünf Decks verfügt, in etlichen Episoden, außerdem auch im Kinofilm Star Trek: Der erste Kontakt, zu sehen, bis es schließlich zerstört wird. Wenig später wird die fast baugleiche USS São Paulo in Defiant umbenannt und Deep Space Nine zugeteilt.

Von seinen beiden Vorgängerserien unterschied sich DS9 anfangs vor allem durch die Abkehr des Handlungsortes von einem beweglichen Raumschiff hin zur Zentrierung auf eine ruhende Raumstation. Nicht mehr der Aufbruch der Menschheit zu neuen Grenzen stand im Vordergrund, sondern das Verteidigen dieser Grenzen und das Sichern des Erreichten. In den Reaktionen der Zuschauer schlug sich allerdings Kritik an diesem Konzept nieder, dabei wurde beklagt, die Serie sei zu intellektuell, zu politisch, zu düster, zu unversöhnlich und entspreche nicht stark genug dem ursprünglichen Star-Trek-Konzept. Als Reaktion auf den Publikumsdruck wurden mit Beginn der dritten Staffel zwei neue Elemente in die Serie eingefügt. Dabei handelte es sich zum einen um das Dominion, eine als bedrohlich charakterisierte Macht im Gamma-Quadranten, zum anderen um die USS Defiant, ein im Verhältnis zur Enterprise kleines Raumschiff, das es der Besatzung von DS9 ermöglichen sollte, sich gegen das Dominion zu verteidigen und auch außerhalb der Raumstation in größerem Umfang zu agieren. Entgegen dem ursprünglichen Konzept war damit das Element der Bewegung ein Teil der Serie. Zur Erhöhung der Zuschauerzahlen und zur Deckung der Produktionskosten beschlossen die Produzenten nochmals, mit Beginn der vierten Staffel die Episoden handlungsreicher, spannender und interessanter zu gestalten. Dies versuchten sie durch das Aufnehmen des bereits aus den Vorgängerserien bekannten Volks der Klingonen in die Handlung und der Figur Worfs in die Hauptbesetzung, bekannt aus Raumschiff Enterprise – Das nächste Jahrhundert.

Das US-amerikanische Fernsehmagazin TV Guide bezeichnet DS9 als „die am besten gespielte, geschriebene, produzierte und insgesamt beste“ Inkarnation von Star Trek. Die Presse findet, DS9 sei die dramaturgisch beste Serie der Star-Trek-Reihe:„Nie war sie so detailliert durchdacht, wurden die Charaktere über Jahre so intensiv entwickelt, die Spannungsbögen so klar gezeichnet.“ Die Dialoge zwischen Sicherheitschef Odo und dem Barkeeper Quark gehörten zum Amüsantesten, was die Autoren im Star-Trek-Universum jemals generiert hätten. Kabel eins meint, dass sich DS9 hinsichtlich Spannung und Komplexität von Staffel zu Staffel gesteigert habe. Filmreporter kritisiert, dass die Qualität der Folgen etwas schwanke und dass besonders die „zunehmend kriegerischen“ späteren Staffeln an Charme verlören.

Cineman findet, dass die dritte Staffel mehr Action biete und weitaus temporeicher sei als die beiden vorgegangenen. Das neu hinzugekommene Raumschiff Defiant sorge für mehr Abwechslung.

Die sechste Staffel vermöge die vorherige an Spannung sogar noch leicht zu übertrumpfen, so dicht sei die Atmosphäre der Serie um die drohende Invasion des Dominion.

In der siebten Staffel werde Action im Überfluss geboten, was meistens in riesigen und für eine TV-Serie spektakulären Weltraumschlachten gegen das Dominion ende. Bei einzelnen Episoden der finalen Staffel falle allerdings eine gewisse Überlastung an Handlungssträngen auf, der Abgang der Hauptcharaktere falle im letzten Teil etwas hektisch aus. Dennoch finde DS9 einen würdigen Schluss.

Dieser Ableger des Star-Trek-Universums traf in der Fangemeinde vor allem zu Beginn der Serie sowohl auf Begeisterung als auch auf Ablehnung. Vor allem die dunklere Gestaltung, die Häufung von Konflikten innerhalb der Crew und der zunehmend militärische Unterton setzten Deep Space Nine denn auch klar von dem auf den ersten Blick unkomplizierteren Raumschiff Enterprise aus der zweiten Star-Trek-Serie ab.

Doch nach deren Ende machte Deep Space Nine mit seinen Drehbüchern, Spezialeffekten sowie komplexen Handlungs- und Charakterentwicklungen zunehmend Eindruck. Als erste Star-Trek-Serie entwickelte Deep Space Nine zudem einen „roten Faden“, der die einzelnen Folgen zunehmend zu einer einheitlichen Storyline mit einer Vielzahl an periodisch wiederkehrenden Nebencharakteren verwob. Dies gilt rückblickend als größte Stärke der Serie, erschwerte später hinzugekommenen Zuschauern jedoch den Einstieg.

Zudem wird Deep Space Nine von vielen Fans, meistens den wohlwollenden, als Seifenoper im Weltraum bezeichnet. Dies lässt sich angesichts erstmals vorhandener langfristiger Liebesbeziehungen der Hauptcharaktere (siehe Benjamin Sisko und Kasidy Yates) und den Verwicklungen der Crew untereinander auch nicht ganz verleugnen. Die beiden vorherigen Serien hatten meist nur kurzfristige Liebesbeziehungen zugelassen, um den Hauptcharakteren Möglichkeiten offen zu lassen.

Deep Space Nine wurde insgesamt 31-mal für den Emmy nominiert, je Staffel einmal in den Kategorien Make-up und Frisur sowie mehrfach in den Kategorien Künstlerische Leitung, Musik, Visuelle Spezialeffekte und Kostümdesign. Drei Prämierungen gab es, darunter eine für die Titelmusik sowie zwei für das Make-up. 

Darüber hinaus wurde DS9 fünfmal mit dem ASCAP Music Award und bei neun Nominierungen einmal mit dem Saturn Award prämiert. Nominierungen gab es zudem für den Young Artist Award, den Golden Satellite Award und den NAACP Image Award.